Употреба и мере предострожности епрувете за ултрафилтрациону центрифугу
1) Изаберите одговарајућу ултрафилтрациону цев.Имајте на уму да се УФ мембране разликују по степену толеранције на различите хемикалије.Типично, ултрафилтрационе епрувете са граничном молекулском тежином од 10 кДа могу да се изаберу са ограничењем молекулске тежине које не би требало да буде веће од 1/3 молекулске тежине протеина од интереса, као што је 35 кДа.Ако је молекулска тежина протеина од интереса око 10 кд, може се користити ултрафилтрациона цев са граничном молекулском тежином од 3 КД.
(2) Ултрафилтрација, свеже купљена, је сува, са ултрачистом водом додатом пре употребе и водом која је потпуно прошла кроз мембрану, ледено купатило или фрижидер претходно охлађена неколико минута.Затим се одлије вода, односно протеинска течност, и колико се дода, шта год није више од беле линије на врху епрувете.Операција је лагана, а ултрафилтрациона епрувета се мора претходно охладити на леду пре додавања протеинског раствора.
3) И маса и центар гравитације требало је да достигну равнотежу.Имајте на уму да брзина ротације и убрзање нису веома брзи, иначе директно оштећују ултрафилтрациону мембрану.Започета је центрифугална ултрафилтрација (центрифуга претходно охлађена на 4 степена).Након што је број обртаја различитих центрифуга претворен у г, био је другачији.Убрзање центрифуге је подешено на минимум, смањујући притисак на мембрану.Напомена, обавезно напустите центрифугу након што центрифуга достигне своју одредишну брзину, или ако имате проблем, не можете да се носите са њим први пут.Оријентација мембране према вретену је подешена према упутству (кућиште угаоне центрифуге је мембрана на осу окомита).У практичној употреби, општа брзина ротације је мања од оне у упутствима, тако да се животни век цеви за центрифугу може продужити.
3) И маса и центар гравитације требало је да достигну равнотежу.Имајте на уму да брзина ротације и убрзање нису веома брзи, иначе директно оштећују ултрафилтрациону мембрану.Започета је центрифугална ултрафилтрација (центрифуга претходно охлађена на 4 степена).Након што је број обртаја различитих центрифуга претворен у г, био је другачији.Убрзање центрифуге је подешено на минимум, смањујући притисак на мембрану.Напомена, обавезно напустите центрифугу након што центрифуга достигне своју одредишну брзину, или ако имате проблем, не можете се носити с њим први пут.Оријентација мембране према вретену је подешена према упутству (кућиште угаоне центрифуге је мембрана на осу окомита).У практичној употреби, општа брзина ротације је мања од оне у упутствима, тако да се животни век цеви за центрифугу може продужити.
(4) Када се концентрише до преосталих 1мл, узмите 50ул пуферског раствора, додајте 10ул протока и видите да ли има плаве боје, као процену да ли ултрафилтрационој цеви недостаје протеин.Ако епрувета цури, поново сипајте горњи слој и протицајте у нову цев да бисте започели ултрафилтрацију.Да бисте прецизно утврдили да ли су епрувете пропуштене, центрифугирајте 10 минута са 5мгмл БСА пре протока, радећи на протеинском лепку или Брадфордовом сировом тесту, и наставите додавањем преосталог концентрованог раствора протеина (који делује на леду и спречава загревање протеина) док сав концентрат је додат.Водите рачуна током центрифугирања ако дође до преципитације протеина, што доводи до затварања епрувете.Ако дође до падавина, утврдите да ли је специфични узрок преципитације прекомерна концентрација протеина или неодговарајући пуфер;Први се може решити ултрафилтрацијом више ултрафилтрационих епрувета истовремено, смањујући концентрацију, а други разменом различитих пуферских раствора док не дође до преципитације протеина.
(4) Када се концентрише до преосталих 1мл, узмите 50ул пуферског раствора, додајте 10ул протока и видите да ли има плаве боје, као процену да ли ултрафилтрационој цеви недостаје протеин.Ако епрувета цури, поново сипајте горњи слој и протицајте у нову цев да бисте започели ултрафилтрацију.Да бисте прецизно утврдили да ли су епрувете пропуштене, центрифугирајте 10 минута са 5мгмл БСА пре протока, радећи на протеинском лепку или Брадфордовом сировом тесту, и наставите додавањем преосталог концентрованог раствора протеина (који делује на леду и спречава загревање протеина) док сав концентрат је додат.Водите рачуна током центрифугирања ако дође до преципитације протеина, што доводи до затварања епрувете.Ако дође до падавина, утврдите да ли је специфични узрок преципитације прекомерна концентрација протеина или неодговарајући пуфер;Први се може решити ултрафилтрацијом више ултрафилтрационих епрувета истовремено, смањујући концентрацију, а други разменом различитих пуферских раствора док не дође до преципитације протеина.
(5) Првих неколико корака се користи за концентрисање протеина, и ако се пуфер мења, лагано додајте нови пуфер (ултрафилтрација кроз ултрафилтрациону мембрану од 0,22ум) на око 1мл укупног протеина и поново концентришите на око 1мл током три узастопних пута, са коначном концентрованом коначном запремином у зависности од жељене концентрације протеина, генерално не више од 500ул, али такође до 200ул.Остварите 1000 × или више у три наврата, у суштини исто толико промене бафера, колико се израчунава обогаћивањем запремине од најмање 10 × сваки пут.
(5) Првих неколико корака се користи за концентрисање протеина, и ако се пуфер мења, лагано додајте нови пуфер (ултрафилтрација кроз ултрафилтрациону мембрану од 0,22ум) на око 1мл укупног протеина и поново концентришите на око 1мл током три узастопних пута, са коначном концентрованом коначном запремином у зависности од жељене концентрације протеина, генерално не више од 500ул, али такође до 200ул.Остварите 1000 × или више у три наврата, у суштини исто толико промене бафера, колико се израчунава обогаћивањем запремине од најмање 10 × сваки пут.
Време поста: 09.11.2022