ПЦР, је ланчана реакција полимеразе, која се односи на додавање дНТП, Мг2+, фактора елонгације и фактора појачања амплификације систему под катализом ДНК полимеразе, користећи матичну ДНК као шаблон и специфичне прајмере као почетну тачку екстензије, Кроз кораке денатурације, жарења, екстензије, итд., процес ин витро репликације ћерке ДНК ланца комплементарне ДНК матичног ланца шаблона може брзо и специфично појачати било коју циљну ДНК ин витро.
1. Хот Старт ПЦР
Време почетка амплификације у конвенционалном ПЦР-у није да се ПЦР машина стави у ПЦР машину, а затим програм почиње да се умножава.Када се конфигурација система заврши, почиње амплификација, што може да изазове неспецифично појачање, а ПЦР са врућим стартом може да реши овај проблем.
Шта је ПЦР са врућим стартом?Након што је реакциони систем припремљен, ензимски модификатор се ослобађа на високој температури (обично вишој од 90°Ц) током почетне фазе загревања реакције или фазе „хот старт“, тако да се активира ДНК полимераза.Тачно време активације и температура зависе од природе ДНК полимеразе и модификатора врућег старта.Овај метод углавном користи модификаторе као што су антитела, лиганди афинитета или хемијски модификатори за инхибицију активности ДНК полимеразе.Пошто је активност ДНК полимеразе инхибирана на собној температури, технологија врућег старта пружа велику погодност за припрему вишеструких ПЦР реакционих система на собној температури без жртвовања специфичности ПЦР реакција.
2. РТ-ПЦР
РТ-ПЦР (Реверзна транскрипција ПЦР) је експериментална техника за реверзну транскрипцију из мРНК у цДНК и њено коришћење као шаблон за амплификацију.Експериментални поступак је да се прво екстрахује укупна РНК у ткивима или ћелијама, користи се Олиго (дТ) као прајмер, користи се реверзна транскриптаза за синтезу цДНК, а затим се цДНК користи као шаблон за ПЦР амплификацију да би се добио циљни ген или открила експресија гена.
3. Флуоресцентни квантитативни ПЦР
Флуоресцентни квантитативни ПЦР (Квантитативни ПЦР у реалном времену,РТ-кПЦР) се односи на метод додавања флуоресцентних група у ПЦР реакциони систем, користећи акумулацију флуоресцентних сигнала за праћење целог процеса ПЦР у реалном времену, и на крају користећи стандардну криву за квантитативну анализу шаблона.Најчешће коришћене кПЦР методе укључују СИБР Греен И и ТакМан.
4. Нестед ПЦР
Нестед ПЦР се односи на употребу два сета ПЦР прајмера за два круга ПЦР амплификације, а производ амплификације другог круга је фрагмент циљног гена.
Ако неусклађеност првог пара прајмера (спољних прајмера) узрокује амплифицирање неспецифичног производа, могућност да исти неспецифични регион буде препознат од стране другог пара прајмера и да настави да се амплификује је веома мала, тако да амплификација са другим паром прајмера, побољшана је специфичност ПЦР-а.Једна од предности извођења два круга ПЦР-а је та што помаже у амплификацији довољног производа из ограничене почетне ДНК.
5. Тоуцхдовн ПЦР
Тоуцхдовн ПЦР је метод за побољшање специфичности ПЦР реакције подешавањем параметара ПЦР циклуса.
У тоуцхдовн ПЦР-у, температура жарења за првих неколико циклуса је постављена неколико степени изнад максималне температуре жарења (Тм) прајмера.Виша температура жарења може ефикасно да смањи неспецифичну амплфикацију, али у исто време, виша температура жарења ће погоршати раздвајање прајмера и циљних секвенци, што резултира смањеним приносом ПЦР.Због тога, у првих неколико циклуса, температура жарења се обично поставља да се смањи за 1°Ц по циклусу како би се повећао садржај циљног гена у систему.Када се температура жарења спусти на оптималну температуру, температура жарења се одржава током преосталих циклуса.
6. Директан ПЦР
Директни ПЦР се односи на амплификацију циљне ДНК директно из узорка без потребе за изолацијом и пречишћавањем нуклеинске киселине.
Постоје две врсте директног ПЦР-а:
директна метода: узмите малу количину узорка и додајте је директно у ПЦР Мастер Мик за ПЦР идентификацију;
метода крекирања: након узорковања узорка, додајте га у лизат, лизујте да бисте ослободили геном, узмите малу количину лизираног супернатанта и додајте га у ПЦР Мастер Мик, извршите ПЦР идентификацију.Овај приступ поједностављује експериментални радни ток, смањује време практичног рада и избегава губитак ДНК током корака пречишћавања.
7. СОЕ ПЦР
Спајање гена преклапајућим проширењем ПЦР (СОЕ ПЦР) користи прајмере са комплементарним крајевима да би ПЦР производи формирали преклапајуће ланце, тако да у следећој реакцији амплификације, кроз продужавање преклапајућих ланаца, различити извори А технике у којој се амплификовани фрагменти преклапају и спојени заједно.Ова технологија тренутно има два главна правца примене: конструкција фузионих гена;мутација усмерена на генско место.
8. ИПЦР
Инверзни ПЦР (ИПЦР) користи реверзне комплементарне прајмере за амплификацију ДНК фрагмената који нису два прајмера и амплификује непознате секвенце са обе стране познатог ДНК фрагмента.
ИПЦР је првобитно дизајниран да одреди секвенцу суседних непознатих региона, и углавном се користи за проучавање секвенци промотора гена;онкогена хромозомска преуређивања, као што су фузија гена, транслокација и транспозиција;и интеграција вирусних гена, такође се обично користе сада. За мутагенезу усмерену на место, копирајте плазмид са жељеном мутацијом.
9. дПЦР
Дигитални ПЦР (дПЦР) је техника за апсолутну квантификацију молекула нуклеинске киселине.
Тренутно постоје три методе за квантификацију молекула нуклеинске киселине.Фотометрија се заснива на апсорпцији молекула нуклеинске киселине;флуоресцентни квантитативни ПЦР у реалном времену (ПЦР у реалном времену) заснива се на вредности Цт, а вредност Цт се односи на број циклуса који одговара вредности флуоресценције која се може детектовати;дигитални ПЦР је најновија квантитативна технологија заснована на методи ПЦР са једним молекулом за бројање нуклеинских киселина. Квантитификација је апсолутна квантитативна метода.
Време поста: 13.06.2023